Для выделения их в чистую культуру Зенген применил простой, но эффективный метод. Он приготовил раствор минеральных солей, необходимых для развития микробных клеток и добавил парафин в качестве источника углерода и энергии. В колбы с полученной средой ученый внес комочки почвы. Поскольку парафин являлся единственным органическим веществом в среде, развивались только те микроорганизмы, которые могли его усваивать.
Так Зенген выделил 6 видов микобактерий, которые хорошо развивались на нефти или ее очищенных фракциях — бензине, парафиновом масле, твердом парафине. Исследования Зенгена помогли понять, каким образом из каналов и рек постепенно исчезает нефть, оставленная судами. Ее разлагают микроорганизмы. Позднее парафинокисляющие «лучистые грибки» были найдены и другими исследователями в различных почвах, воде и иле водохранилищ. Особенно богаты ими почвы и пластовые воды нефтеносных районов, а также почвы на территории гаражей, нефтеперерабатывающих заводов, стоянок сельскохозяйственных машин и т. д.
На протяжении последних десятилетий интерес ученых к изучению углеводородокисляющих микроорганизмов заместно возрос. Многочисленные исследования связаны с биотрансформацией, биодеградацией и биоремедиацией нефтяных углеводородов (УВ), и вопросы использования нефтедеградирующих организмов для очистки окружающей среды сегодня занимают центральное место в нефтяной микробиологии.
Результатом научных трудов в этой области стали различные разработки по биоремедиации нефти, в том числе активные штаммы-нефтедеструкторы и их консорциумы, на основе которых в России и за рубежом производятся коммерческие биопрепараты для ликвидации углеводородных загрязнений.
Это и "Путидойл", и "Деворойл", "Бамил", "Петро Трит", "Сойлекс", "Фаерзайн" и т.д. Помимо жизнеспособных клеток микробов они содержат различные добавки во всевозможных сочетаниях (навоз+опилки, сорбент+ферменты+минеральные добавки и т.д.).
Научно-исследовательские центры, занимающиеся разработкой подобных биопрепаратов, в настоящее время работают по четырем направлениям:
1) Выделение активных штаммов-биодеструкторов из аборигенной микрофлоры нефтеносных районов, сочетание нескольких штаммов в одной композиции для расширения условий применения, доказательство непатогенности подобных препаратов, - в этом направлении идет работа в России, Украине, некоторых странах ЕС (например, Чехии и Великобритании);
2) Создание препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, что позволяет расширить диапазон и, опять же, однозначно говорить о безопасности применения, - пионеры в этой области США и Япония;
3) Использование вместо живых культур нефтедеструкторов их активных ферментных систем, и/или обработка загрязнений биогенными веществами (пребиотиками, биосурфактантами), активизирующими аборигенную микрофлору;
4) Разработка методов комплексного биологического воздействия на нефтяные загрязнения, когда нефтесодержащий отход вначале подвергают обработке различными биологически активными веществами, упрощая и ускоряя вторую стадию, - воздействия биопрепарата, что значительно сокращает общие сроки утилизации отходов. К этому пункту можно отнести и создание многокомпонентных композиций, указанных выше: микроорганизмы, иммобилизованные на сорбенте+многочисленные пребиотические добавки, ПАВы.
Микробные препараты-биодеструкторы УВ нефти в установленном порядке проходят сертификацию и одобряются к применению. Однако недропользователи зачастую относятся к подобным технологиям скептически из-за их относительно высокой стоимости, узкого диапазона применения, а экологи выступают против интродукции микроорганизмов в окружающую среду. Дело в том, что непродуманное внедрение активных штаммов в среду может вызывать экологический дисбаланс, необратимо изменяя состав аборигенного микробиоценоза.
Кроме того, многие углеводородокисляющие микроорганизмы являются условно-патогенными и при определенных условиях могут вызывать инфекции человека и животных. Однако доказанных фактов вспышек эпидемических заболеваний в результате мер по биодеградации нефтяных загрязнений нет. Более того, современные молекулярно-биологические техники позволяют точно идентифицировать используемые культуры микроорганизмов и на ранних этапах исключить патогенные штаммы из разработки препарата.
С другой стороны, необходимо отметить, что промышленное производство многих биопрепаратов не организованно должным образом, для их получения используются субстраты, по химической природе отличающиеся от УВ, что может приводить к проблемам в последующем использовании в реальных условиях; не в полном объеме проработаны технологические приемы очистки нефтезагрязненного материала биопрепаратами.
Это отражается на результатах деятельности многочисленных фирм-подрядчиков, предлагающих на рынке биологические методы очистки. К сожалению, зачастую они не могут продемонстрировать хорошие результаты очистки (особенно в России), - это связано с многочисленными нарушениями технологии применения биопрепаратов, их сомнительным качеством и низкой активностью.
Объективные сложности, сопутствующие применению микробных препаратов-биодеструкторов обусловлены, в первую очередь, условиями роста и жизнедеятельности микроорганизмов, входящих в их состав.
Эффективность планируемых работ с биопрепаратами зависит от следующих факторов:
1. Количество вылившихся нефтепродуктов, площадь, глубина и степень загрязнения почв и вод;
2. Возраст загрязнения и, соответственно, текущий состав нефтепродуктов;
3. Распределение УВ по компонентам почвы и гидросферы, их биодоступность;
4. Продолжительность вегетационного перода (с круглосуточно положительными значениями температуры воздуха и поверхности почвы);
5. Тип, влагосодержание, кислотность и другие физико-химические параметры загрязнённой почвы или нефтешлама, их целевое назначение, а также особенности местного микробиоценоза, растительности;
6. Возможность принудительной аэрации загрязнённого объекта;
7. Местные нормативы предельно допустимого содержания нефти и нефтепродуктов в грунте (например, стандарт ЕС чистой почвы составляет 400 ppm, а в РФ экологи иногда поднимают эту планку до фоновых 100 ppm).
Итак, оптимальная влажность процессов биодеструкции углеводородов в почве составляет 60-65%, и как правило, для стимулирования естественных процессов самоочистки требуется регулярный полив.
Процессы разложения углеводородов происходят главным образом в аэробной среде. Обеспеченность кислородом зависит от типа почвы, ее влажности, природы субстрата (окисленные, полуокисленные или бескислородные углеводороды), структуры микробного сообщества, и нередно возникает необходимость проводить периодическое рыхление. Кислотность почвы играет также важную роль - в природных условиях микроорганизмы-биодеструкторы активны в узкой области pH (нейтральные, или близкие к нейтральным значения). Оптимальный уровень рН создается при помощи агрохимических мероприятий.
Для стимуляции деятельности микроорганизмов необходимо проводить химическую мелиорацию с внесением минеральных солей. Расчет доз минерального питания микроорганизмов производится после определения доступных форм азота, фосфора, калия, магния на объекте и установления недостающего количеста элементов питания до оптимальной концентрации.
В первом приближении исходят из того, что на потребление микроорганизмами 1 части УВ теоретически необходимо 0,1-0,15 части биогенных элементов, причем половина из них приходится на азот (в аммонийной форме), а оставшаяся часть - в равном соотношении на фосфор и калий. Для ускорения очистки иногда добавляют навоз и опилки в количестве 25% от массы нефтесодержащих осадков.
Вышеуказанные мероприятия необходимы и при использовании методов активизации аборигенной микрофлоры без дополнительного внедрения чужеродных штаммов.
Количество и тип биопрепаратов для утилизации УВ определяется природой загрязнения, его концентрацией, химическим составом сопутствующих веществ и условиями проведения работ. На основании результатов лабораторных и полевых исследований подтверждено изменение степени биодеградабельности различных компонентов загрязнения в соответствии со следующей закономерностью (в порядке убывания): растительные масла > пищевые жиры > парафины > дизельное топливо, керосин, бензин, газовый конденсат > нефтемасла > мазут > сырая нефть.
Таким образом, ориентировочное соотношение биопрепарат/загрязняющие вещества выражается следующими данными:
- сырая нефть, мазут, кондесированные ароматические УВ – 1:10;
- машинное и моторное масла, вазелины, тяжелые фракции парафинов - 1:100;
- газовый конденсат, дизельное топливо, бензин, керосин, авиационное топливо, циклоалканы - 1:1000;
- н-алканы, растительные масла и животные жиры - 1:10000.
Из-за неравномерного химического и минералогического состава почв различных регионов на практике количество биопрепаратов определяется по результатам химического анализа объекта, подвергаемого очистке. Принимается, что для утилизации 1 т сырой нефти требуется не менее 5 кг биопрепарата.
Естественно, что в природных условиях с непостоянством климатических и физико-химических параметров, а также наличием факторов, ингибирующих рост микроорганизмов, продолжительность утилизации значительно возрастает и требует не только увеличения стартовых количеств, но и дополнительных внесений биопрепаратов и минеральных удобрений.
Наибольшую активность биопрепараты проявляют при концентрации нефти от 0,05 до 10,0%. При степени загрязнения выше 5% рекомендуется повторное внесение биогенных элементов для стимуляции процесса деструкции нефти. В зависимости от предварительно проводимой оценки загрязненного УВ нефти участка принимается решение о проведении работ по биологической утилизации отходов прямо на месте (in situ-биоремедиация) или же применении ex situ-технологий, предполагающих съем загрязненного грунта или выемку нефтешлама из шламонакопителя.
Следует помнить, что при свежем загрязнении УВ 20 % и выше, возможно, будет рентабелен процесс переработки отходов с выделением товарных компонентов нефти при помощи специализированного оборудования и последующей биоремедиацией получившийся твердой фазы.
Возможен также вариант эффективной (и быстрой) очистки отходов с высоким содержанием УВ, при котором обработка биопрепаратом производится в биореакторе. Получаемые продукты можно использовать в качестве удобрений под технические культуры или в парковом хозяйстве.
Как видно, очистка с применением микробных препаратов-нефтедеструкторов самих по себе является весьма сложным и неоднозначным по результативности процессом. Поэтому для утилизации нефтешламов и нефтезагрязненных грунтов необходима разработка комплексных технологий, включающих модуль применения биопрепаратов как составную часть успешного процессинга отходов. Подобные методики позволяют получать наименее опасные отходы (5-й класс опасности).
В качестве иллюстрации может служить нижеприведенная схема (литературные данные):
Нефтяной шлам подается в емкость, где происходит смешение со специально подобранным эмульгатором (биоПАВ) и разогрев его от 40 до 80°С. Далее нефтешлам подается в декантирующую центрифугу. Под действием центробежной силы в декантирующей центрифуге происходит разделение на три фазы: водную, нефтяную и твердую. Вода отводится в емкость и далее направляется на очистные сооружения.
Нефтяная фаза выходит в промежуточную подогреваемую емкость и далее перекачивается на завод. Твердая фаза транспортируется на полигон, где производят биологическую доочистку с применением подобранного консорциума непатогенных нефтеокисляющих микроорганизмов.
Таким образом, в настоящее время мнение специалистов в обсуждаемой области склоняется к тому, что для ликвидации нефтяных загрязнений и утилизации нефтесодержащих отходов необходимо сочетать различные механические и химические воздействия, а на завершающем этапе проводить биологическую доочистку до экологически и санитарно безопасного уровня. Такие комплексные решения обеспечивают максимальную степень эффективности и безопасности для окружающей среды.
Авторы: Сергей Серый (ООО «Эколого-аналитический центр газовой промышленности»); Борис Анохин (Пермский Государственный Университет)
